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一、 轉(zhuǎn)錄組測序概述

轉(zhuǎn)錄組是特定物種、組織或細胞類型轉(zhuǎn)錄的所有RNA（轉(zhuǎn)錄本）的集合，包括mRNA和非編碼RNA(Non-coding RNA， 非編碼RNA又包括：tRNA，rRNA，snoRNA，microRNA，piRNA，lncRNA等。通過比較轉(zhuǎn)錄組或基因表達譜的研究以揭示生物學現(xiàn)象或疾病發(fā)生的分子機制是高通量組學研究的一個常用策略。利用高通量測序技術研究轉(zhuǎn)錄組在全面快速得到基因表達譜變化的同時，還可以通過測定的序列信息精確地分析轉(zhuǎn)錄本的cSNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性）、可變剪接等序列及結(jié)構(gòu)變異，另外對于檢測低豐度轉(zhuǎn)錄本和發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本具有其獨特的優(yōu)勢。

二、 轉(zhuǎn)錄組測序技術優(yōu)勢

1. 直接得到核酸序列信息，除了得到基因表達量的差異，更可以檢測RNA的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)變異。
2. 開放性的轉(zhuǎn)錄組分析：無需參考基因組信息，無需設計探針，不但能檢測已知基因還能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本。
3. 在測序覆蓋率足夠大時能夠檢測到細胞中的低豐度轉(zhuǎn)錄本。
4. 隨著測序深度的增加可以獲得更廣的動態(tài)檢測范圍，能夠同時鑒定和定量高豐度轉(zhuǎn)錄本和低豐度轉(zhuǎn)錄本。

三、研究內(nèi)容

基因表達水平研究：基因表達是將基因中蘊含的遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯等轉(zhuǎn)變成功能產(chǎn)物的所有加工過程，是生物生命活動的基礎和關鍵?；驈?span>DNA 轉(zhuǎn)錄成RNA 是基因表達的首要步驟。基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA 豐度不同很大程度地影響到基因最終功能產(chǎn)物的分子濃度。因此，檢測基因在RNA水平的表達量即基因轉(zhuǎn)錄得到的RNA 的豐度成為人們研究基因表達的關鍵方法。

研究流程示例

 

轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)變異研究：利用單堿基分辨率的RNA-Seq 技術可極大地豐富基因注釋的很多方面, 包括5′/3′邊界鑒定、UTRs區(qū)域鑒定以及新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域鑒定等。在發(fā)現(xiàn)序列差異(如融合基因鑒定、編碼序列多態(tài)性研究)方面, RNA-Seq 也展示了其很大的潛力。

研究流程示例

四、 轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒灱夹g路線

 

樣品要求（RNA）
樣品純度：OD 260/280值應在1.9～2.2 之間，RNA 28S:18S≥1.5，推薦 RIN≥7；DNA 應該去除干凈。
樣品濃度：最低濃度不低于100ng/μl。
樣品總量：每個樣品總量不少于7μg。
樣品溶劑：要溶解在H20或TE (pH 8.0)中。
樣品運輸： RNA用凍存管保存，并用干冰或液氮運輸。

數(shù)據(jù)分析技術路線及數(shù)據(jù)分析內(nèi)容（無參考基因組）

 

 

1. 數(shù)據(jù)預處理
目的：對原始測序數(shù)據(jù)進行一定程度的過濾。
原理：根據(jù)測序接頭以及測序質(zhì)量對原始的測序數(shù)據(jù)進行預處理，其中，測序質(zhì)量Q與測序錯誤E之間的關系如下：

 結(jié)果：對預處理后質(zhì)量以及堿基分布統(tǒng)計進行統(tǒng)計

2. UniGene拼接
目的：將預處理后reads進行拼接，得到拼接結(jié)果。
原理： 應用 de Bruijn graph path 算法對reads進行de novo拼接；對上一步的拼接結(jié)果，再用Hamilton Path算法拼接。
結(jié)果：UniGene序列，UniGene統(tǒng)計信息，序列長度分布圖

3. 數(shù)據(jù)庫注釋
目的：對拼接得到的UniGene進行功能注釋
原理：通過blast+算法將拼接得到的UniGene序列與數(shù)據(jù)庫進行比對
結(jié)果：比對結(jié)果表格，物種分布統(tǒng)計和Evalue分布統(tǒng)計

4. UniGene表達分析
目的：UniGene定量分析。
原理：以UniGene為reference，分別將每個樣本的reads進行reference mapping ,從而得到每個樣本在每個UniGenes中的一個reads覆蓋度，然后應用RPKM/FPKM標準化公式對富集片段的數(shù)量進行歸一化。

 

UniGene表達分布圖，1X，5X分別為FPKM=1，FPKM=5分界點，可以大體觀察到低表達，中表達以及高表達的比例關系

UniGene樣本間表達相關性散點圖    樣本間表達差異程度的MA圖，可以體現(xiàn)差異表達總體偏差

5. UniGene表達差異分析
目的：對定量結(jié)果進行統(tǒng)計檢驗分析，找出差異表達UniGene 
原理：雙層過濾篩選差異基因
FC值篩選：采用Fold-change(FC)，表達差異倍數(shù)進行第一層此的差異基因篩選
FDR檢驗：一般采用卡方檢驗中的fisher精確檢驗進行p值檢驗，采用Benjamini FDR(False discovery ratio)校驗方法對p值進行假陽性檢驗，即，通過FDR顯著性參數(shù)進行第二層次的差異基因篩選。
結(jié)果展示：

 

6. GO功能分類
目的：利用數(shù)據(jù)庫注釋信息將 UniGene進行 GO 功能分類。
原理：利用數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，應用blast2GO算法進行GO功能分類，得到所有序列在Gene Ontology 的三大類：molecular function, cellular component, biological process 的各個層次所占數(shù)目，一般取到14層。
結(jié)果：MF，BP，CC三大分類結(jié)果文件以及 UniGene2GO 關系列表，三大類別中第二層次上的柱狀分布圖和餅圖，GO功能的層次分布圖。

 

7. KEGG代謝通路分析
目的：對拼接得到 UniGene 進行 KEGG pathway 映射。
原理：應用KEGG KAAS在線 pathway比對分析工具對拼接得到的UniGene進行KEGG映射分析。
結(jié)果：標記的Pathway通路圖。

8. COG注釋
目的：對拼接得到 UniGene 進行 COG功能分類。
原理：利用blast+算法將拼接得到的UniGene與CDD庫中的COG/KOG庫進行比對，進行COG功能分類預測，將其映射到COG分類中。
結(jié)果： COG分類分布情況圖。

9. SSR重復序列注釋
目的：對拼接得到 UniGene進行 SSR 簡單重復序列的查找。
原理：篩選標準：單核苷酸重復的次數(shù)在10次或10次以上，二核苷酸重復的次數(shù)在 6次或6次以上，三至六核苷酸重復的次數(shù)在 5次或 5次以上。同時，也篩選中間被少數(shù)堿基 (間隔小于100或等于100)打斷的不完全重復的SSR。
結(jié)果：重復序列的信息文件以及統(tǒng)計文件。

10. LncRNA預測
目的：對拼接得到的UniGene進行LncRNA(Long noncoding RNA)預測。
原理： 通過以下過程對UniGene進行過濾，最終得到候選LncRNA序列。
1) Unigene length > 200bp；
2) Unigene ORF(Open Reading Frame) length < 300；
3) 將滿足長度條件的UniGene與多個近源物種進行進化分析，得到序列的保守性和進化特性；
4) 根據(jù)上述的特性和已知數(shù)據(jù)庫中coding、noncoding區(qū)域的特性建立編碼篩選模型；
5) 將符合noncoding模型的UniGene與Pfam等蛋白域數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，進一步去除可能的編碼特性，最終得出LncRNA預測結(jié)果。

數(shù)據(jù)分析技術路線及數(shù)據(jù)分析內(nèi)容（有參考基因組）

1. 數(shù)據(jù)預處理
目的：對原始測序數(shù)據(jù)進行一定程度的過濾。
原理：根據(jù)測序接頭以及測序質(zhì)量對原始的測序數(shù)據(jù)進行預處理，其中，測序質(zhì)量Q與測序錯
誤E之間的關系如下：

2. 比對基因組
目的：將經(jīng)過預處理的測序數(shù)據(jù)與參考基因組進行相似性比對。
原理：Burrower-Wheeler轉(zhuǎn)換算法與splicing比對算法。
1）Burrower-Wheeler轉(zhuǎn)換算法：由于測序數(shù)據(jù)量非常大，與整條基因組比對所需資源與時間是較為巨大的。目前，我們采用Burrower-Wheeler(BWT)算法對基因進行建立索引、堿基壓縮等過程，這樣可以很大程度上加快比對速度，減少比對過程中所需資源。
2）splicing比對算法：即分段比對算法，當某條測序序列位于轉(zhuǎn)錄本剪切位點時，也就是這條序列同時屬于兩個外顯子，如果將它與參考基因組進行比對，由于基因組兩個外顯子之間含有intron區(qū)，那么它將無法找到它合適的位置；但是應用分段比對算法就可以將這條測序序列分割變成多段子序列，然后應用這些段子序列與基因組進行比對，這樣就可以找到它們真正的位置。

 

3. 基因表達水平研究
目的：應用基因組比對結(jié)果進行基因定量。
原理：從指定物種基因模型(基因結(jié)構(gòu))中得到gene、exon、intron以及UTR等位置信息，通過
基因組比對結(jié)果計算出在不用區(qū)域富集片段數(shù)目，然后應用RPKM/FPKM標準化公式對富集片
段的數(shù)量進行歸一化。

 

4. 差異表達分析
目的：應用統(tǒng)計學方法對基因在樣本間的表達差異進行分析。
原理：雙層過濾篩選差異基因。
FC值篩選：采用Fold-change(FC)，表達差異倍數(shù)進行第一層此的差異基因篩選。
FDR檢驗：一般采用卡方檢驗中的fisher精確檢驗進行p值檢驗，采用Benjamini FDR(False discovery ratio)校驗方法對p值進行假陽性檢驗，即，通過FDR顯著性參數(shù)進行第二層次的差異基因篩選。
結(jié)果展示：

 

5. 轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析
目的：偵測不同類型的可變剪切事件。
原理：通過測序序列的splicing事件來偵測可能發(fā)生剪切連接的候選exon，通過已有可變剪切方式進行驗證，最終得出真實的可變剪切事件。
結(jié)果展示：對常見的可變剪切方式進行統(tǒng)計分析。

6. 新轉(zhuǎn)錄本預測
目的：預測antisense transcript以及intron transcript。
原理：通過測序序列在基因組上富集的方向性進行反義轉(zhuǎn)錄本預測，如果有富集區(qū)域方向與基
因轉(zhuǎn)錄本方向相反且達到一定的富集閾值，即可認為其為antisense transcript。將完全位于
intron區(qū)的一段富集片段作為intron transcript。

7. 新基因預測
目的：預測intergenic區(qū)可能存在的新基因并對新基因進行功能注釋。
原理：首先，得到在基因間區(qū)有測序序列富集的一些段區(qū)域；然后，排除那些已經(jīng)有注釋的那些段區(qū)域作為候選的新基因。

結(jié)果展示：

8. 基因融合分析
目的：尋找可能發(fā)生融合功能的基因
原理：通過測序片段的splicing事件以及pair-end測序的距離信息進行基因融合位點的定位，
如果一個測序片段的一個子片段與geneA匹配，另一子片段與geneB匹配，那么geneA與geneB有可能為一個融合基因，而當pair-end雙向測序時，一對測序片段中一個與geneA匹配，另一個與geneB匹配，那么geneA與geneB有可能為一個融合基因。如果同時滿足兩個條件，那么融合發(fā)生的可能性就較大。結(jié)果展示見右圖。

9. GO富集分析
目的：對差異基因相關GO功能進行富集分析。

 

顯著富集GO功能圖形統(tǒng)計

10. KEGG富集分析
目的：對差異基因進行KEGG通路富集分析。
原理：應用物種自己的KEGG pathway進行富集分析，富集結(jié)果更加貼近物種現(xiàn)實功能實現(xiàn)的通路，尤其對目前功能注釋尚不完全的物種，如，大豆、玉米、葡萄、楊樹、白菜、牛、羊等物種的KEGG通路分析。

11. cSNV查找

目的：在轉(zhuǎn)錄水平找出變異位點或者片段。
原理：通過測序數(shù)據(jù)得到基因組每個位點的堿基富集情況；然后，統(tǒng)計每個點富集富集的堿基
種類，得出可能存在的變異(即，與參考基因組堿基不同且富集程度較高的堿基類別)。
結(jié)果展示：

12. LncRNA預測
目的：對新轉(zhuǎn)錄本進行LncRNA(Long noncoding RNA) 預測。
原理：通過以下過程對新轉(zhuǎn)錄本進行過濾，最終得到候選LncRNA序列：
1) 通過基因組比對得到4類新轉(zhuǎn)錄本：Intergenic transcript、Full intron transcript、Antisense transcript、Overlapped with known transcript，將這些新轉(zhuǎn)錄本用于LncRNA預測；
2) New Transcript length > 200bp；
3) New Transcript ORF(Open Reading Frame) length < 300；
4) 將滿足長度條件的New Transcript與多個近源物種進行進化分析，得到序列的保守性和進化關系；
5) 根據(jù)上述的特性以及已知數(shù)據(jù)庫中coding、noncoding區(qū)域的特性建立編碼篩選模型；
6) 將符合noncoding模型的New Transcript與Pfam等蛋白域數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，進一步去除可能的編碼特性，最終得出LncRNA預測結(jié)果。

13. LncRNA保守度分析
1) lncRNA 序列保守性分析lncRNA 序列保守性分析
基于multiple genome alignment進行序列保守性分析。lncRNA的序列保守性用其序列比對的identity來表示。

2) lncRNA結(jié)構(gòu)保守性分析
通過使用RNAz軟件，推斷基于多序列比對的一致結(jié)構(gòu)，比較二級結(jié)構(gòu)自由能與一致結(jié)構(gòu)的自由能，得到每一段aligned region 的SCI 值，并以此作為二級結(jié)構(gòu)的表征，SCI 越大則結(jié)構(gòu)越保守。

3) LncRNA二級結(jié)構(gòu)預測
根據(jù)lncRNA的序列保守性，使用RNAalifold軟件，可以同時看到其序列比對結(jié)果和保守的二級結(jié)構(gòu)。